摘要：在过去的二十年里，一次性婴⼉湿巾的开发取得了重大进展。湿巾由两个主要成分组成：无纺布和液体。湿纸巾含有90%以上的水分，因此比一般的个⼈护理产品更容易滋生微生物；因此，通常使用高浓度的防腐化合物来确保更长时间的防污染保护。然而，存在将刺激性活性物的浓度最⼩化的明显趋势。婴⼉湿巾应含有特别温和的表面活性剂、耐受性良好的防腐剂和缓冲系统，以将配方的pH值维持在适合婴儿皮肤的水平。努力集中在去除具有刺激性的成分。此外，⼈们正在转向使用更天然的面料。然而，这些修改在保存最终产品方面引发了新的挑战。纤维的性质和成分会影响防腐剂和擦拭巾之间的相互作用，进而影响防腐系统的性能。在这项研究中，我们分析了湿巾保存挑战的原因。我们发现含有天然纤维的织物是主要的污染源，促进了其表面生物膜的生成。此外，亲水亲油平衡（HLB）被用来合理化织物和防腐剂之间的物理化学相互作用。随后影响防腐系统的性能。在这项研究中，我们分析了湿巾保存挑战的原因。我们发现含有天然纤维的织物是主要的污染源，促进了其表面生物膜的生成。此外，亲水亲油平衡（HLB）被用来合理化织物和防腐剂之间的物理化学相互作用。随后影响防腐系统的性能。在这项研究中，我们分析了湿巾保存挑战的原因。我们发现含有天然纤维的织物是主要的污染源，促进了其表面生物膜的生成。此外，亲水亲油平衡（HLB）被用来合理化织物和防腐剂之间的物理化学相互作用。
⼀、简介
湿巾最初是作为个⼈护理产品开发的，但随着时间的推移，它们已成为越来越受欢迎的家庭日常用品。通常，湿巾由两个主要部分组成：无纺布载体（湿巾）和液体。抹布容纳并散布液体或收集并容纳污垢或其他要去除的物质。浸渍湿巾的液体主要是水，但也含有表面活性剂、缓冲剂和防腐剂。非织造织物被广泛定义为通过缠结纤维或长丝以机械、热或化学方式粘合在一起的片材或网状结构。用于生产擦拭物的纤维可以是天然的，例如木浆，或合成的，例如聚丙烯、聚酯(PET)，或它们的组合。低成本合成纤维是湿巾的主要原料，而包括木浆、粘㬵（再生纤维素产品）和棉花在内的天然纤维可用于微调最终产品的所需特性。不同的成分通常转化为厚度、吸收性和柔软度的变化。 生产无纺布的方法有多种，在本研究中，我们使用了水刺技术生产的织物。非织造布的最终尺寸特性，包括表面密度、厚度、孔隙率（空隙体积与织物总体积的⽐率）、孔径和结构，将主要影响纤维强度、柔韧性、吸收性和液体扩散行为。一般来说，体积孔隙率较高，无论所用亲水/疏水纤维的含量如何，都具有更高的垂直芯吸率。各种水刺工艺参数会对上述纤维结构特性产生影响，例如水刀压力、输送速度、纤⽹质量和纤⽹成分。之前有⼈提出，织物的某些物理化学特性会影响细菌对表面的粘附。
湿纸巾含有大量水分(>90%)，因此容易滋生微生物。因此，湿巾中使用的水从高纯度到反渗透质量不等。水处理过程去除了大部分盐分（碳酸钙和碳酸镁，有助于整体硬度）和其他可作为微生物营养物质的残留矿物质。此外，许多供水系统在使用前采用紫外线处理对水进行消毒。因此，湿巾中的水质量高于标准饮用水。需要添加常见的有机酸（苹果酸或柠檬酸）和共轭碱（柠檬酸钠、碳酸氢钠或磷酸钠）来调节湿巾配方的pH值以匹配皮肤表面的pH值。配方中使用了多种能够充分去除皮肤污垢的阴离子、阳离子和非离子表面活性剂。对于婴⼉湿巾，表面活性剂含量非常低（通常<1%w/w)，这与沐浴露、洗发水和洗手液等瓶装婴⼉产品形成鲜明对比，后者的表面活性剂浓度通常高达20%w/w。
由于无纺布表面积大、含水量高以及生物膜（附着在表面的微生物群落）的形成，湿巾的保存经常面临其他个⼈护理产品没有遇到的挑战。生物膜形成是微生物不可逆地附着在表面并在其上生长的过程，产生细胞外聚合物，促进它们的附着和基质的形成，从而导致微生物生长速率的改变。此外，这些生物膜相关微生物对抗菌剂的敏感性显着降低。
此外，基于纤维素的纤维可以降解为葡萄糖单元，为微生物定植（生物膜）提供合适的营养。纤维素基材料对各种微生物分泌的胞外酶的生物降解性已得到广泛研究。真菌，包括木霉属,青霉属，和镰刀菌属spp.是常见的、高效的纤维素分解酶生产者。B-葡萄糖苷酶,分泌自巴西曲霉,是纤维素基纤维完全水解的必需酶。已发现一系列酶促过程（由微生物引起）会导致糖分子分解代谢，从而在三磷酸腺苷(ATP)中产生储存能量。
在过去的20年里，生物膜得到了广泛的研究，⼈们对微生物附着和初始生物膜形成的过程有了很多了解。微生物生物膜的发展被描述为一个涉及几个步骤的动态过程。首先，细菌细胞通过弱的可逆范德瓦尔斯相互作用附着在表面，这可以发展成更强的粘附附件，例如偶极子、氢、离子或疏水性。第二步对应于第一个附着细胞的生长和分裂促进的微菌落的产生。微菌落逐渐扩大并结合形成覆盖表面的第一层细胞。当多层细胞堆积在表面时，就达到了形成的第三步，表现为成熟的生物膜的存在，高度水化（98%水）并牢固地结合在下层表面。已发现它们的结构在空间和时间上都是异质的，具有水通道，可以将必需的营养素和氧气输送到生物膜内生长的细胞。
一种普遍的营销趋势是，个⼈护理产品以不含有争议的防腐剂成分（例如对羟基苯甲酸酯和甲醛供体）的形式销售，这给婴⼉湿纸巾的保存带来了进一步的困难。因此，在本研究中，我们旨在找出可控制的防腐困难的根源，以设计合理有效的湿纸巾防腐体系。
为此，我们研究了织物成分（使用粘㬵、聚酯及其组合）对湿巾液体配方防腐功效的影响。对聚酯或粘㬵纤维进行了生物膜形成评估，并与粘㬵和PET相比，评估了各种防腐剂的物理化学特性。这些数据使评估防腐剂分子与织物的相容性和效率成为可能。最后，我们对湿纸巾保存困难的根源有了更清晰的认识，从而为进一步开发新型抗菌策略奠定了基础。
二、材料和方法
2.1.材料
苯甲酸（纯度99.99%）购自EmeraldKalamaChemical,(Kalama,WA,USA)。山梨酸(99.3%)和山梨酸钾(99.2%)购自南通醋酸化工有限公司（中国南通）。对羟基苯甲酸甲酯(>99.86%)购自浙江圣效化工有限公司（中国衢州），苯甲酸钠(99.7%)购自武汉有机实业有限公司（中国武汉）。DMDMH(55%)来自SharonLaboratoriesLtd（以色列阿什杜德）。用于擦拭巾的PET、粘㬵和PET-粘㬵组合由NRSpuntechIndustriesLtd（以色列太巴列）友情提供。所有纤维均采用水刺技术生产，也称为水刺工艺，其中使用一系列高速、非常精细的水射流以机械方式互锁和缠结纤维。
2.2.公式以下液体湿巾配方用于挑战测试，以评估湿巾污染的来源（表1）。
表格1。通过挑战测试测试的湿巾液体配方
在某些情况下，挑战测试仅使用盐水作为水相（表2和3），以消除可能影响结果的任何参数，例如表面活性剂。
2.3.挑战测试
之前已经描述了微生物的菌株和生长条件。根据ISO11930规定进行防腐功效的挑战测试。擦拭纤维以1/4的比例浸渍（w/v)使用表1中描述的配方，pH值为5.5，并在塑料袋中分别接种每种微生物（大肠杆菌ATCC8739，金黄色葡萄球菌ATCC6538，铜绿假单胞菌ATCC9027，白色念珠菌ATCC10231，和巴西曲霉16404)，最终浓度为105个‒106个细菌的CFU/mL和104个‒105个用于酵母和霉菌。使用StomacherSTO-4桨式搅拌器（MRC，Holon，Israel）将湿巾彻底匀化，然后密封并在22℃的黑暗中孵育28天。通过在第2、7、14、21和28天的时间点对一张湿纸巾取样来确定防腐效果。为了计算每个时间点的微生物，将液体添加到袋子中以产生高达10的连续稀释,并使用倒板法将1mL接种到具有适当介质TSA/SDA（分别为细菌与酵母）的培养皿中。对于细菌，将平板在32°C下孵育3天，而将酵母和霉菌在22°C下孵育5天，直至对活微生物进行计数。根据美国药典(USP)标准对防腐剂功效进行评估。根据EP验收标准，防腐剂的功效在第2天和第7天分别比最初接种的细菌数减少了100倍和1000倍，这被认为是足够的。此外，根据之前的研究，第14天和第28天之间不应出现细菌计数增加。
2.4.扫描电子显微镜(SEM)
样品在室温下用Karnovsky固定剂（2%PFA、2.5%戊二醛，在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中，pH=7.4）固定4⼩时，然后在4℃下用1/2稀释的Karnovsky固定剂固定过夜。然后将样品放在盖玻片上（涂有0.1%的聚-l-赖氨酸），后固定在1%四氧化锇(OsO4个)在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中2小时，并在一系列分级醇中脱水。然后，将样品在CPD（QuorumTechnologyK850，英国）中干燥并涂上Pd/Au（QuorumTechnologySC7620，英国）。
样品在Quanta200扫描电子显微镜（希伯来大学耶路撒冷，以色列）中成像。使用100万像素相机采集图像，每幅图像的采集时间为60秒。这部分工作由耶路撒冷希伯来大学医学院核⼼研究机构EMUnit（EduardBerenshtein博士）完成。
2.5.亲水亲油平衡(HLB)计算Griffin的亲水亲油平衡(HLB)公式（公式1）被利用，源自非离子表面活性剂领域[28,29]。根据Griffin的说法，两亲性分子的HLB是通过将亲水部分的重量分数除以分子的总重量并乘以20得到的值，得出0到20范围内的结果。HLB值为0对应于高度疏水分子，而值20对应于高度亲水分子。通过比较不同防腐剂分子以及粘㬵和PET（在其单体形式下）的HLB值，我们旨在评估防腐剂与织物成分之间的亲和力。
三、结果与讨论
3.1.储存和使用过程中的污染源
为了确定湿纸巾污染的来源，在最终湿纸巾配方中含有0.45%水性防腐剂混合物（由0.3%苯甲酸钠和0.15%山梨酸钾组成）的湿纸巾的液相在存在的情况下通过挑战测试进⾏了检查并且没有无纺布。液体制剂的组成如表1所述。图1显示了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和巴西曲霉微生物对两种湿法中0.45%有机酸的敏感性。擦拭液体系：不引⼊织物的湿擦拭液和与80/20PET/粘㬵非织造布接触的湿擦拭液。挑战结果表明，当无纺布没有湿巾（图1A），挑战测试符合EP测试标准，而在80/20PET/粘㬵织物存在的情况下，它没有（图1B）。这表明织物和/或由于其存在而可能产生的相互作用会导致湿巾液体系统的污染。
图1。由0.3%苯甲酸钠和0.15%⼭梨酸钾组成的有机酸防腐混合物(0.45%)的挑战测试：无擦拭织物的(A)和存在的(B)。数据以CFU/mL的log10表示。
为了弄清楚织物的哪一部分造成了污染以及污染的程度，我们检查了含有防腐剂的同⼀湿巾液体系统与四种不同类型的织物结合使用时的功效：100%PET，90/10%PET/粘㬵、80/20%PET/粘㬵和100%粘㬵。含有湿巾液体系统的织物分别与两种选定的微生物一起培养，大肠杆菌和铜绿假单胞菌,如图2所示。
100%PET和100%粘㬵之间的比较显示，100%粘㬵织物的存在导致微生物生长相对于接种物水平的增加，而在100%PET存在的情况下，微生物水平降低。令⼈惊讶的是，10%、20%或100%粘㬵的存在并没有显着影响细菌数量，这表明即使是适度的纤维素含量也会促进细菌的生长。
图2。四种织物组合的挑战测试：100%PET、90/10%PET/粘㬵、80/20%PET/粘㬵和100%粘㬵——在孵育2天后浸渍含有0.45%有机酸混合物的防腐剂系统和大肠杆菌和铜绿假单胞菌.数据以CFU/mL的log10表示。
100%PET非织造布的平均孔径尺寸先前已被发现高于具有相同水射流压力的100%粘㬵非织造布。当粘㬵纤维添加到PET中时，如图2所示，与100%PET相比，平均孔径逐渐减小。孔体积和孔径大⼩是影响细菌粘附和滞留的重要因素。细菌更喜欢粘附在纤维之间的缝隙和内部毛孔中；因此，纤维之间更⼩的间隙或更⼩的孔径（随后导致更⼩的总孔体积）与细菌粘附减少相关。先前研究的这些观察结果与我们在图2中的结果相矛盾，其中粘㬵纤维的百分比增加，平均孔径较小，与100%PET纤维相比，导致细菌生长增加。这强调了化学因素的重要性，以粘㬵纤维和PET纤维的极性差异为代表，它超越了以孔径为代表的物理因素的影响。
3.2.粘㬵和PET无纺布上的生物膜形成
在这项研究中，SEM被用来检测生物膜在10个孵育3⼩时后6个CFU/毫升的铜绿假单胞菌,大肠杆菌，和金黄色葡萄球菌微生物分别在粘㬵纤维和PET纤维上（图3）。粘㬵纤维的SEM图像显示大的细菌菌落呈现为生物膜，而PET纤维表面看起来相当“干净”。众所周知，微生物菌落产生的细胞外聚合物（即生物膜）主要由多糖组成；因此，可以合理地假设这些多糖很容易粘附在多糖纤维素织物上。因此，生物膜确实有利于在粘㬵表面形成，而不是在PET表面形成，对后者的亲和力有限。这些观察结果与挑战测试（图2）的结果⼀致并得到证实，强调粘㬵织物在湿巾污染中起着关键作用。
图3。扫描电子显微镜(SEM)图像描绘了暴露于铜绿假单胞菌,大肠杆菌，和金黄色葡萄球菌粘㬵（上图）与PET（下图）纤维表面上的微生物（从左到右）。
3.3.评估防腐剂/织物相容性的HLB计算
化妆品市场上有各种各样的防腐剂，但需要选择合适的分子才能在最终产品中提供最大功效。为了确定无纺布分子结构与防腐剂分子之间的预测相容性，使用了格里芬的亲水亲油平衡(HLB)公式。
HLB=20∙ Mw亲水性/总分子量
正如预期的那样，如图4所示，PET织物的HLB值低于粘㬵织物。引⼈注目的是，发现所有检测的防腐剂分子的HLB值均低于PETHLB，表明它们甚至比最疏水的织物纤维(PET)更疏水。因此，我们可以得出结论，湿巾行业最常用的防腐剂（即有机酸、中链乙二醇、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸酯）对疏水织物（即PET、聚乙烯）具有较高的物理化学亲和力，而对疏水性织物（即PET、聚乙烯）具有较低的亲和力适用于亲水性织物，如粘㬵和其他纤维素材料。考虑到这些防腐剂在水中的溶解度也有限。例如，在图1和图2的测试中使用的有机酸混合物仅为6。
此外，先前的研究表明，随着表面接触角的增加，细菌粘附会减少；因此，有较低的润湿性和更多疏水表面。当微生物在亲水基质中培养时，它们会倾向于与亲水表面相互作用。
图4。基于Griffin⽅法的各种防腐剂以及PET和粘㬵纤维的HLB值。
为验证防腐剂与织物之间的亲和力差异及其与保鲜效果的关系，进行了以下实验。在第一组中，平行进行了两项挑战测试（表2），比较含和不含100%PET织物的盐溶液，两种溶液都用0.2%对羟基苯甲酸甲酯保存。对羟基苯甲酸甲酯的HBL值为8（图4），在水中的溶解度很低，仅为0.25%，logP高达1.96。在没有纤维的盐水处理中观察到微生物数量立即减少，而在PET存在的情况下，抗菌活性可以忽略不计。这些结果表明，疏水性防腐剂对羟基苯甲酸甲酯与疏水性PET织物的高亲和力导致水溶液中缺乏抗菌保护。
表2。在不存在与存在100%PET织物的情况下，在盐水中对0.2%对羟基苯甲酸甲酯进行挑战测试。
*TNTC：多得数不过来。
为了进一步验证这一概念，平行进行了第二组两项挑战测试（表3），比较了含和不含100%PET纤维的盐溶液，两种溶液都用0.5%DMDMH（55%活性物质）保存。后者的HLB值高于粘㬵（高亲水性），在水中的溶解度>55%，并且对数较低P的价值−1.2；因此，预计它与PET织物的亲和力较低。事实上，这两个挑战测试在存在和不存在PET织物时都表现出非常相似的抗菌性能。因此，可以合理地假设亲水性防腐剂与PET的亲和力非常低，从而使DMDMH具有在两种水溶液中发挥抗菌作用的潜力。
表3。在不存在与存在100%PET织物的情况下，盐水中0.275%活性DMDMH的挑战测试。
四、结论
本研究旨在准确确定湿巾保存免受微生物污染的固有困难的根本原因。为此，在⼀系列实验中使用了各种微生物学和物理化学工具，以揭示非织造布成分与常用防腐剂之间存在的相互作用。结果使合理化这些相互作用与抗菌功效之间的联系成为可能。因此，粘㬵亲水材料被发现是污染的理想载体，正如所有三种测试微生物中覆盖有生物膜结构的粘㬵纤维的SEM图像清楚地显示的那样。它的纤维素材料使其成为微生物的内在食物来源并促进微生物定植。支持这些发现， 另一方面，发现PET疏⽔材料对微生物相当惰性，这可以在SEM图像中观察到。尽管如此，有证据表明它在污染中起着非常重要的间接作用。事实上，正如通过使用对羟基苯甲酸甲酯（表2）的挑战测试所观察到的，这是一种HBL值为8的相当低的疏水性防腐剂（图4），当将疏水性PET纤维引入水相时，防腐剂功效显着降低。由于目前用于湿巾的绝大多数防腐剂都是疏水性的，它们很可能会与疏水性无纺布元件发生相互作用，从而使亲水性纤维素（粘㬵）材料以及水相无法充分保护并暴露于污染中。 我们认为，最大保存位点和最大污染位点之间的严重不匹配是由于目前使用的防腐剂和无纺布系统的性质之间的关系不充分造成的。因此，为了纠正这种情况，考虑一种适用于基于更亲水性和抗生物膜能力的防腐系统的方法是合乎逻辑的。我们目前正致力于开发这种防腐系统，将在以后的文章中发表。
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Citation:Salama, P.; Gliksberg, A.; Cohen, M.; Tzafrir, I.; Ziklo, N. Why Are Wet Wipes so Difficult to Preserve? Understanding the Intrinsic Causes. Cosmetics2021,8, 73. https://doi.org/10.3390/ cosmetics8030073 Academic Editor: Enzo Berardesca
从1960年第一张湿巾面世以来，湿巾产品是越来越细分了。现在按照大类来分都有婴儿湿巾、湿厕纸、卸妆湿巾、女士卫生湿巾、物表消毒湿巾、车用湿巾、宠物湿巾、家居清洁湿巾等等不胜枚举。更别说一款宠物湿巾都分为：宠物洗澡湿巾、宠物毛发护理湿巾、宠物泪痕湿巾、宠物牙齿清洁湿巾、宠物杀菌除螨湿巾等。
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